Рейтинг@Mail.ru
(495) 7-999-000 Адрес офиса
Корзина
ДИАГНОСТИКА ЦЕРЕБРАЛЬНОГО ТОКСОПЛАЗМОЗА У ВИЧ-ИНФИЦИРОАННЫХ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Введение.

ВИЧ-инфекция сопровождается  прогрессирующей деструкцией иммунной системы.  Основные пути проникновения вируса в мозг и ликвор – гематогенный и периневральный (1,2). Поражение нервной системы при ВИЧ/СПИДе обусловлено воздействием не только самого вируса, но и может осложняться оппортунистическим инфекциями, возбудители которых активируются в условиях иммунодефицита. Чаще всего основной причиной патологии центральной нервной системы при СПИДе, вызванной условно-патогенными микроорганизмами, является токсоплазмоз, который развивается обычно при снижении количества CD4 клеток до 100 и менее в 1 мкл крови (3).

Токсоплазмоз— широко распространенная зоонозная паразитарная инфекция, характеризующаяся полиморфизмом клинических проявлений и значительной вариабельностью течения процесса: от здорового, бессимптомного носительства до тяжелых, летальных форм болезни. Известно (4), что T.gondii инфицированность от 70 до 80% населения в зависимости от географического региона. У большинства людей иммунной системе удается контролировать развитие заболевания, но при угнетении иммунитета инфекция  имеет тенденцию поражать мозг и вызывать проблемы с речью и ходьбой. Поражение центральной нервной системы чаще всего протекает в виде церебрального, базального арахноидита; развивается гипертензионный и диэнцефальный синдромы, выявляются вегетососудистые нарушения, отмечается эписиндром. Больные СПИДом, инфицированные T.gondii, как правило, погибают. Летальность ВИЧ-инфицированных от нейроинфекции, вызванной токсоплазмозом, выше, чем  от других возбудителей оппортунистических заболеваний.

Поскольку клинические проявления нейроинфекции различной этиологии носят обычно неспецифический характер,  точная и  быстрая диагностика возбудителя на ранних этапах заболевания имеет решающее значение для проведения  своевременной терапии, которая позволяет предупредить или замедлить прогрессирование патологического процесса, продлить жизнь ВИЧ-инфицированного и сохранить ее качество. Метод ПЦР обнаруживает ДНК T.gondii в крови и ликворе только у 30-50% больных с активным токсоплазмозом (2, 3, 5).

Для диагностики токсоплазмоза в широкой лабораторной практике обычно используют серологические методы, чаще иммуноферментный анализ (ИФА). Данный метод отличается простотой постановки, не требует сложного оборудования, автоматически учитывает результат анализа и позволяет быстро и с высокой достоверностью выявить возбудитель независимо от места его локализации в организме (6). Большинство иммуноферментных тест-систем разных производителей, предназначены для определения антител к T.gondii в сыворотке/плазме крови человека.

Цель нашей работы состояла в определении диагностических возможностей иммуноферментной тест-системы «DIA-Toxo-IgG» для выявления  IgG к T.gondii в ликворе при нейроинфекции  у  больных с подтвержденным диагнозом ВИЧ.

Материалы и методы.

Исследуемые образцы.

Материалом для исследования являлись ликвор и сыворотка крови, забор которых  у больных ВИЧ проводили одновременно, у некоторых пациентов – с интервалом 12-14 дней. Образцы для анализа  сохраняли при – 20оС и затем тестировали в одной постановке ИФА.

Пациенты.

Обследовано 20 пациентов (14 мужчин и 6 женщин)  в IV стадии ВИЧ-инфекции в возрасте 31-44 года с клиническими проявлениями менингита или менингоэнцефалита, которые находились на лечении в стационарной отделении Центра профилактики и борьбы со СПИДом Ивано-Франковской области. Каждому пациенту проводили общеклиническое обследование, диагностическую люмбальную пункцию, КТ и ЯМР головного мозга, бактериоскопию ликвора на микобактерии туберкулеза и криптококки, исследование сыворотки крови на IgM и IgG к возбудителям TORCH-инфекций (CMV, HSV 1 и 2 типов, Toxoplasma gondii) методом ИФА, определение ДНК герпесвирусов, микобактерий туберкулеза, токсоплазм в ликворе методом ПЦР.

У всех пациентов диагностирована нейроинфекция с различной степенью патологии. По результатам обследования больных  1 пациенту поставлен диагноз прогрессирующая полифокальна лейкоэнцефалопатия, 7 -  гнойный менингит, 1 -туберкулезный менингит, 1 -  криптококковый менингит, 1 - криптококковый менингит в сочетании с гнойным менингитом, 2 - герпесвирусный (HSV1) энцефалит, 7 - очаговый церебральный токсоплазмоз. Очаговый токсоплазмозный энцефалит был монопатологией только у 3-х пациентов,  у остальных он сочетался с другой патологией ЦНС: криптококковым менингитом - 2,  абсцессом головного мозга - 1, Эпштейна-Бар вирусным энцефалитом и криптококковым менингитом - 1.  

Часть пациентов исследована до и после проведенной антивирусной и противопаразитарной терапии.

Контрольную группу составляли ВИЧ-инфицированные, отрицательные по токсоплазмозу.

Метод ИФА.

Исследуемый материал тестировали с использованием диагностической иммуноферментной тест-системы «DIA-Toxo-IgG» (ЧАО НПК «Диапроф Мед»). Тест-система сконструирована в формате непрямого ИФА. В составе иммуносорбента использованы очищенные природные антигены T/gondii, с которыми связываются специфические антитела на первом этапе реакции. После промывки иммуносорбента в реакцию вводят специфический пероксидазный конъюгат, изготовленный на основе мышиных моноклональных антител к IgG человека, которые выявляют образовавшиеся иммунные комплексы. Иммуноферментную реакцию проявляют раствором ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидина), в состав которого входит перекись водорода. Останавливают реакцию раствором серной кислоты.

При проведении тестирования сывороток крови на IgG к T.gondii, согласно Инструкции к тест-системе,  исследуемый образец  предварительно перед постановкой ИФА разводили 1:50 буфером для разведения исследуемых образцов. С помощью калибраторов, которые входят в состав набора и откалиброваны относительно 3-го Международного стандарта ВОЗ (Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, NIBSC), строили калибровочную кривую и полученное значение  концентрации специфических IgG в сыворотке крови выражали в МЕ/мл. Кроме этого, в проведенных нами исследованиях анализируемый материал дополнительно разводили указанным буфером 2-кратно: сыворотки крови с 1:50 до 1:400, а ликвор – с 1/10 до 1/160. Результат анализа при этом выражали соотношением ОП/cut off, где

ОП – оптическая плотность, полученная при тестировании исследуемого образца,

cut off – граничное значение, которое рассчитывали по формуле:

срК-   + 0,15,

срК-  - среднее значение оптической плотности, полученное при анализе трех дублей отрицательного контроля,

0,15 – поправочный коэффициент.

Использование данного соотношения одновременно при учете результата анализа сыворотки крови и ликвора позволило сравнить концентрации IgG к T.gondii,  как персистирующих, так и локализованных в нервной ткани организма больного.

Результаты и обсуждение.

При исследовании ВИЧ-инфицированных с нейроинфекцией специфические IgG к T.gondii в сыворотке крови выявлены у 65 % больных (13 человек из 20 обследованных). У всех пациентов с положительным результатом на токсоплазмоз в организме персистировали специфические иммуноглобулины класса G в достаточно высоких концентрациях 70 – 176 МЕ/мл, которые указывали на перенесенное заболевание в прошлом (табл.1,.2).

При анализе ликвора данных больных у 84,6 % (11 больных из 13) были обнаружены  IgG к T.gondii. У одного больного (№6), у которого  концентрация специфических IgG в сыворотке крови составила 58 МЕ/мл, ликвор не исследовался. Отмечено, что при последовательном  2-кратном разведении 14 образцов ликвора, в которых тест-система выявила IgG к T.gondii, в  9 образцах (64, 3 %) специфические антитела обнаружены в исследуемом материале до его разведения 1:400, в 2 образцах - до разведений 1:100, 1:200 соответственно,. Необходимо отметить, что у всех пациентов, у которых IgG к T.gondii присутствовали в ликворе, они выявлялись и в сыворотке крови. Это свидетельствует о невозможности изолироанного появления специфических антител в ликворе при отсутствии их в крови. У 3 больных (№4, №5, №11) в ликворе которых обнаружены специфические IgG, по результатам КТ, диагноз токсоплазмоза не был установлен. Двое из них умерло, так и не получив своевременно специфической терапии. У одного больного после выписки через 1 месяц развился токсоплазменный множественный хориоретинит со значительным снижением зрения. В дальнейшем по анамнезу всем 3  больным был поставлен диагноз токсоплазмоз мозга.  При исследовании  больного (№13), прошедшего курс противопаразитарной терапии,  IgG к T.gondii обнаружены только при разведении ликвора 1:10. Учитывая полученные данные, очевидно, что  именно данное разведение ликвора необходимо использовать как минимальное при проведении ИФА, чтобы  исключить возможность получения ложноотрицательных результатов при тестировании ликвора в тест-системе «DIA-Toxo-IgG».

У одного пациента (№10) IgG к T.gondii обнаружены только в сыворотке крови. По результатам расширенного обследования у него не подтвержден диагноз церебральный токсоплазмоз.

Сравнительный анализ значений соотношения ОП/cut off, полученных при исследовании образцов ликвора (в разведении 1:10), отобранных с интервалом  12-14 дней у больных, позволил установить снижение количества IgG к T.gondii у пациента  № 1 с положительной динамикой заболевания в ходе проведения лечения (табл.1).

У 8 больных (контрольная группа - № 7, 8, 9, 12, 14, 15, 16, 17) мы не обнаружили IgG к T.gondii при исследовании в тест-системе «DIA-Toxo-IgG» образцов сывороток крови и ликвора.

Полученные данные по количеству IgG к T.gondii при нейроинфекции  у ВИЧ-инфицированных,  персистирующих в организме и локализованных в нервной ткани,  представлены в табл.2. По результатам тестирования сывороток крови и ликвора в одинаковых 2-кратных разведениях от 1:50 до 1:16400 специфические антитела в ликворе выявлялись в меньших разведениях и с меньшими значениями ОП/cut off, чем в сыворотке у каждого больного. Очевидно, что у больных на ранних этапах развития нейроинфекции обсемененность возбудителем нервной ткани меньше, чем внутренних органов.

Таким образом, проведенные нами исследования образцов ликвора и сывороток крови  ВИЧ-инфицированных с нейроинфекцией показали, что диагностические возможности иммуноферментной тест-системы «DIA-Toxo-IgG» позволяют выявлять IgG к T.gondii в указанном материале с высокой чувствительностью.. При этом ликвор перед тестированием необходимо разводить 1:10 раствором для разведения исследуемых образцов, который входит в состав тест-набора. Высокая информативная способность тест-системы определяет возможность ее использования в алгоритме диагностики этиологического фактора нейроСПИДа. Поскольку из всех оппортунистических инфекций токсоплазмоз в условиях иммунодефицита  у больных ВИЧ представляет реальную угрозу их жизни, своевременное выявление возбудителя  токсоплазмоза в качестве причины нейроинфекции предупредит осложнения в ходе развития заболевания.

Литература.

1. ВИЧ-инфекция: клиника, діагностика и лечение. 2-е изд./В.В. Покровский, Т.Н. Ермак, В.В. Беляєва и др.– М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.

2. Запорожан В.М. ВИЧ-инфекция и СПИД/ В.М. Запорожан, М.Л. Аряєв.   [2-е узд перероб. и доп.] – К. : “Здоров’я”, 2004 р. - 636с.

3. Церебральный токсоплазмоз // Лечение ВИЧ-инфекции, 2005 р./ под ред. Кристиана Хоффмана, Юргена К. Рокстро, Бернда Себастьяна Кампса. – 2005. [Електронний ресурс]. Режим доступу до кн. : http://www.HIVMedicine.com.

4. Ковалева Н.М. Токсоплазмоз как оппортунистическая инфекция / Н.М. Ковалева // Сучасні інфекції. – 2000.- №1. – С.44-50.

5. Возианова Ж.И. Инфекционные и паразитарне болезни : учебное пособие [для студ. висш. мед. учебн. учрежд.] в 3 т. / Ж.И.  Возианова – К. : «Здоров’я», 2002. - Т.3. - 2002. – С.285-315.

6. Крамарев С.О. Лабораторна діагностика токсоплазмозу у вагітних і дітей / С.О. Крамарев, Л.В. Пипа // Лабораторна діагностика. – 2003. - №1. – С.21-25.

Грижак Игорь Игнатьевич  -  к.м.н., доцент кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Ивано-Франковського национального медицинского университета, Украина,

Дикий Богдан Николаевич  - д.м.н., профессор, заведующий кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Ивано-Франковського национального медицинского университета, Украина,

Прокофьева Ольга Алексеевна - заведующая лаборатории Центр профилактики и борьбы со СПИДом Ивано-Франковской области,

Ганова Лариса Александровна – к.б.н., заведующая лаборатории иммунохимии

ЧАО НПК «Диапроф-Мед», Киев, Украина,

Шепелин Константин Анатольевич, директор по развитию ООО «Эпидбиомед-диагностика», Москва, Россия


Табл.№1

Результаты сравнительного тестирования сыворотки крови и ликвора ВИЧ-инфицированных

с подозрением на токсоплазмоз в тест-системе «DIA-Toxo-IgG».

боль-

ного

gробы*

Результаты ИФА сыворотки крови

Результаты ИФА ликвора

Токсоплазмоз подтвержден

МЕ/мл

разведения

разведения

1/50

1/100

1/200

1/400

1/10

1/20

1/40

1/80

1/160

ОП/cut off**

ОП/cut off*

1

I

160

16,2

15,8

14,3

11,3

12,7

11

10,6

5,5

0,2

да

II

84

14,8

14,1

13,1

11,8

4,8

2,6

1,1

0,3

0,1

2

I

155

15,7

13,1

12,1

11,4

19,6

14,7

16,1

15,7

6,4

да

3

I

175

17,6

15,3

13,2

9,6

17,6

17,9

16,7

15,8

5,8

да

II

130

15,3

14,9

13,5

13,1

12,5

4

I

167

16,8

16,8

16

15,7

14,3

12

11,9

9,4

0,7

обосн.***

II

81

14,4

13,8

13,6

13

12,6

10,7

7,4

5,5

2,8

5

I

176

17,5

16,9

15,9

14,8

16,9

16,7

15

9,9

5

обосн.***

II

81

14,4

13,4

13,1

13

10,7

7,9

5,1

2,8

1,4

6

I

58

6,3

3,1

1,4

0,3

7

I

отр.

0,2

0,05

0,06

0,02

0,1

0,1

0,08

0,07

0,07

нет

II

отр.

0,08

0,04

0,04

0,04

0,08

0,04

0,03

0,02

0,03

8

I

отр.

0,07

0,05

0,04

0,06

0,2

0,1

0,2

0,07

0,08

нет

9

I

отр.

0,1

0,08

0,03

0,03

0,07

0,05

0,05

0,05

0,07

нет

10

I

70

12,9

12,2

11,8

10,5

0,05

0,04

0,04

0,04

0,04

нет

11

I

87

0,09

0,06

0,05

0,06

13,2

11,8

10,3

9,2

8,3

обосн.***

II

89

0,1

0,07

0,04

0,04

14,8

14,2

12,9

11

10,5

12

I

отр.

0,06

0,05

0,04

0,04

0,04

0,03

0,04

0,04

0,03

нет

13

I

154

15,5

15,1

13,1

11,2

2

0,8

0,2

0,07

0,05

нет

14

I

отр.

0,1

0,07

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,04

0,04

нет

15

I

отр.

0,08

0,05

0,03

0,02

0,06

0,07

0,06

0,08

0,07

нет

16

I

отр.

0,04

0,05

0,04

0,04

0,1

0,5

0,1

0,1

0,1

нет

17

I

отр.

0,07

0,05

0,04

0,03

0,05

0,05

0,04

0,02

0,02

нет

*- интервал между I и II взятием пробы составляет 12-14 дней

**- при соотношении ОП/cut off больше 1,0  результат положительный,  меньше 1,0  - отрицательный

***- диагноз обоснованный , но во время стационарного лечения не был установлен и пациенты не получали противопаразитарных препаратов

 


Табл.№2

Результаты сравнительного анализа содержания  IgG к Toxoplasma gondii

в сыворотке крови и ликворе больных ВИЧ

Код

больного

Материал

Результаты ИФА

МЕ/мл

разведения

1/50

1/100

1/200

1/400

1/800

1/1600

1/3200

1/6400

ОП/cut off*

18

кровь

85

8,1

7,6

6,9

5,9

4,7

3,1

1,7

0,8

ликвор

2,6

1,3

0,5

0,2

0,03

0,02

0,02

0,03

19

кровь

88

8,4

8,2

7,7

7,7

7,2

7

6,4

5,3

ликвор

5,1

3,8

2,2

1

0,5

0,1

0,06

0,03

20

кровь

73

7,2

7

6,4

5,8

5

3,6

2,3

1,1

ликвор

4,3

2,7

1,5

0,7

0,3

0,09

0,04

0,02

*- при соотношении ОП/cut off больше 1,0  результат положительный,

     меньше 1,0  - отрицательный