Оценочные испытания иммуноферментной тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab»

Я верю, что когда-нибудь мы будем жить в «нулевом» обществе: «ноль» — новых случаев ВИЧ-инфекции; «ноль» — дискриминации; «ноль» — смертей, обусловленных СПИДом.

Исполнительный директор ЮНЭЙДС
Мишель Сидибе,
Письмо к партнерам, 2011 год.

В мае 2011 года на 64-й сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения государства-члены ВОЗ приняли «Глобальную стратегию сектора здравоохранения по ВИЧ/СПИДу на 2011-2015 годы», призванную к 2015 году остановить распространение ВИЧ/СПИД и положить начало тенденции к сокращению заболеваемости. Одной из стратегических директив, которыми ВОЗ и страны будут руководствоваться в своей деятельности в ближайшие пять лет, является оптимизация результатов профилактики, диагностики, лечения и ухода при ВИЧ-инфекции. Среди мер по предотвращению распространения ВИЧ-инфекции особое внимание уделяется улучшению качества средств диагностики ВИЧ/СПИД.

Проблема ранней диагностики ВИЧ-инфекции остается актуальной и может быть решена внедрением в лабораторную практику высокочувствительных диагностических иммуноферментных тест-систем 4-го поколения. Преимуществом данного комбинированного анализа является возможность одновременного определения в сыворотке или плазме крови антигена р24 ВИЧ-1 и суммарных ВИЧ1/2-специфических антител, что позволяет сократить период диагностического окна и выявлять ВИЧ-инфекцию не ранних сроках.

Разработанная на предприятии Частное акционерное общество «Научно-производственная компания «Диапроф-Мед» тест-система 4-го поколения для диагностики ВИЧ-инфекции сконструирована в «сендвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с двухэтапным внесением конъюгатов и введением мощной системы биотин-стрептавидинового усиления специфического сигнала. Значительное увеличение чувствительности анализа достигнуто применением в составе конъюгатов, выявляющих иммунные комплексы, смеси биотинилированных коротких рекомбинантных и синтетических аналогов вирусных антигенов, а также биотинилированных высокоаффинных моноклональных антител, распознающих антиген р24 ВИЧ-1.

В настоящей работе с использованием международного стандарта антигена р24 ВИЧ-1 и коммерческих панелей сывороток исследованы качественные характеристики и диагностические показатели данной тест-системы.

Материалы и методы

Иммуноферментный анализ
Тест-система иммуноферментная 4-го поколения «DIA-HIV-Ag/Ab».

В составе иммуносорбента тест-системы использованы рекомбинантные антигены Env-1 ВИЧ-1 и Env-2 ВИЧ-2, а также моноклональные антитела (МКАТ), распознающие антиген р24 ВИЧ-1. Конъюгат№1 состоит из смеси биотинилированных конъюгатов на основе МКАТ, распознающих антиген р24 ВИЧ-1, и аналогов вирусных антигенов Env-1 и Env-2. При внесении в лунки планшета образцов ВИЧ-инфицированной крови и конъюгата №1 антиген р24 ВИЧ-1 связывается с МКАТ в составе иммуносорбента и биотинилированного конъюгата. Специфические антитела взаимодействуют одновременно с антигенами Env-1 и Env-2 в составе иммуносорбента и биотинилированного конъюгата. Образовавшиеся комплексы выявляются конъюгатом стрептавидина с перксидазой хрена. Специфические антитела, не связавшиеся с биотинилорованным конъюгатом, выявляются пероксидазными конъюгатами антигенов Env-1 и Env-2 в составе конъюгата №2 (для предотвращения «хук-эффекта»). После отмывания несвязанных компонентов в лунки добавляют раствор проявителя. Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент. Учет результатов проводят на спектрофотометре в двуволновом режиме при длине волны 450/620 нм.

Панели, стандарты, образцы сывороток
Аналитическую чувствительность тест-системы на антиген р24 ВИЧ1 определяли с использованием 1-го Международного стандарта ВОЗ HIV p24 (NIBSC code 90/636).

Способность тест-системы диагностировать раннюю ВИЧ-инфекцию исследовали на 9 сероконверсионных панелях сывороток: HIV6240, HIV 6243, HIV6247, HIV6248, HIV9012, HIV9017, HIV12007 (ZeptoMetrix Corp., США) и PRB 965, PRB 966 (SeraCare Life Sciences, CША).

Диагностическую эффективность тест-системы определяли при тестировании 72 сывороток крови ВИЧ-инфицированных, содержащих специфические антитела в различных концентрациях, из них 32 образца с антителами к ВИЧ-1 и 41 – к ВИЧ-2.

Результаты и обсуждение

Исследование параметра чувствительности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» по выявлению антигена р24 ВИЧ-1 проводили с использованием 1-го Международного стандарта ВОЗ HIV p24 (NIBSC), последовательно разведенного, согласно прилагаемой Инструкции, отрицательной сывороткой от 25 до 0,04 МЕ/мл. По результатам тестирования данных образцов в трех повторах (табл.1.), порог чувствительности тест-системы по антигену р24 ВИЧ1 составил 0,78 МЕ/мл.

Таблица 1: Результаты определения аналитической чувствительности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» по выявлению антигена р24 ВИЧ-1.

Определение способности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» выявлять раннюю ВИЧ-инфекцию проводили с использованием 9 сероконверсионных панелей сывороток. Каждая панель сывороток состояла из образцов от ВИЧ-инфицированного пациента, отобранных в различные сроки и исследованных с использованием коммерческих диагностикумов: ИФА-тест для определения антигена р24 ВИЧ-1, иммуноблот и иммуноферментная тест-система 4-го поколения с СЕ-маркирорвкой (тест-система сравнения).
Результаты проведенных испытаний тест-системы на 7 панелях сывороток производства ZeptoMetrix представлены в табл.2.

Таблица 2: Результаты тестирования сероконверсионных панелей сывороток производства ZeptoMetrix в тест-системе «DIA-HIV-Ag/Ab.

Согласно паспортным данным к панели HIV 6240, образцы №№ 7-12 (21-45 день от первой донации крови) содержат антиген р24 ВИЧ-1, в образце №13  он уже не выявляется, иммуноблот диагностирует антитела с 10-го образца. Тест-система «DIA-HIV-Ag/Ab» и ее коммерческий аналог определяют положительными все сыворотки, начиная с 8-го образца (23 день от первого забора крови у пациента). При тестировании панелей HIV 6243, HIV 6248, HIV 9017, HIV 12007 данные тест-системы 4-го поколения определяли положительными сыворотки с первого образца, в котором обнаружен антиген р24 ВИЧ-1. При тестировании панели HIV 9018 указанные тест-системы определяли положительными образцы  №№ 9-11 (28-35 день от первой донации крови), в то время как тест-система, предназначенная только для выявления антигена р24 ВИЧ-1, выявила его на 3 дня раньше (в образце № 7). В панели HIV 6247 тест система сравнения и «DIA-HIV-Ag/Ab» определяли положительными все сыворотки, начиная с образца № 8.

Результаты тестирования 2-х сероконверсионных панелей производства SeraCare Life Sciences представлены в табл.3. Согласно полученным данным, тест-система «DIA-HIV-Ag/Ab», как и ее аналог 4-го поколения, выявляли положительные сыворотки одновременно с тест-системой, предназначенной для определения антигена р24 ВИЧ-1, и в более ранние сроки, чем иммуноблот.

Таблица 3: Результаты тестирования сероконверсионных панелей сывороток производства SeraCare Life Sciences в тест-системе «DIA-HIV-Ag/Ab.

Для определения параметра чувствительности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» были протестированы сыворотки больных ВИЧ, которые содержали антитела к ВИЧ-1 (32 образца) и ВИЧ-2 (41 образец). Все сыворотки определены положительными с высокими значениями ОП/cut –off (данные не представлены).Таким образом, исследования диагностической способности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» показали, что она имеет высокий показатель чувствительности как по антигену р24 ВИЧ-1, так и специфическим антителам, что позволяет ей выявлять ВИЧ в ранние сроки на уровне лучших коммерческих аналогов, имеющих СЕ-маркировку.