Диагностика церебрального токсоплазмоза у ВИЧ-инфицироанных методом иммуноферментного анализа

ВИЧ-инфекция сопровождается прогрессирующей деструкцией иммунной системы. Основные пути проникновения вируса в мозг и ликвор – гематогенный и периневральный (1,2). Поражение нервной системы при ВИЧ/СПИДе обусловлено воздействием не только самого вируса, но и может осложняться оппортунистическим инфекциями, возбудители которых активируются в условиях иммунодефицита. Чаще всего основной причиной патологии центральной нервной системы при СПИДе, вызванной условно-патогенными микроорганизмами, является токсоплазмоз, который развивается обычно при снижении количества CD4 клеток до 100 и менее в 1 мкл крови (3).

Токсоплазмоз— широко распространенная зоонозная паразитарная инфекция, характеризующаяся полиморфизмом клинических проявлений и значительной вариабельностью течения процесса: от здорового, бессимптомного носительства до тяжелых, летальных форм болезни. Известно (4), что T.gondii инфицированность от 70 до 80% населения в зависимости от географического региона. У большинства людей иммунной системе удается контролировать развитие заболевания, но при угнетении иммунитета инфекция имеет тенденцию поражать мозг и вызывать проблемы с речью и ходьбой. Поражение центральной нервной системы чаще всего протекает в виде церебрального, базального арахноидита; развивается гипертензионный и диэнцефальный синдромы, выявляются вегетососудистые нарушения, отмечается эписиндром. Больные СПИДом, инфицированные T.gondii, как правило, погибают. Летальность ВИЧ-инфицированных от нейроинфекции, вызванной токсоплазмозом, выше, чем от других возбудителей оппортунистических заболеваний.

Поскольку клинические проявления нейроинфекции различной этиологии носят обычно неспецифический характер, точная и быстрая диагностика возбудителя на ранних этапах заболевания имеет решающее значение для проведения своевременной терапии, которая позволяет предупредить или замедлить прогрессирование патологического процесса, продлить жизнь ВИЧ-инфицированного и сохранить ее качество. Метод ПЦР обнаруживает ДНК T.gondii в крови и ликворе только у 30-50% больных с активным токсоплазмозом (2, 3, 5).

Для диагностики токсоплазмоза в широкой лабораторной практике обычно используют серологические методы, чаще иммуноферментный анализ (ИФА). Данный метод отличается простотой постановки, не требует сложного оборудования, автоматически учитывает результат анализа и позволяет быстро и с высокой достоверностью выявить возбудитель независимо от места его локализации в организме (6). Большинство иммуноферментных тест-систем разных производителей, предназначены для определения антител к T.gondii в сыворотке/плазме крови человека.

Цель нашей работы состояла в определении диагностических возможностей иммуноферментной тест-системы «DIA-Toxo-IgG» для выявления IgG к T.gondii в ликворе при нейроинфекции у больных с подтвержденным диагнозом ВИЧ.

Материалы и методы

Исследуемые образцы
Материалом для исследования являлись ликвор и сыворотка крови, забор которых у больных ВИЧ проводили одновременно, у некоторых пациентов – с интервалом 12-14 дней. Образцы для анализа сохраняли при – 20оС и затем тестировали в одной постановке ИФА.

Пациенты
Обследовано 20 пациентов (14 мужчин и 6 женщин) в IV стадии ВИЧ-инфекции в возрасте 31-44 года с клиническими проявлениями менингита или менингоэнцефалита, которые находились на лечении в стационарной отделении Центра профилактики и борьбы со СПИДом Ивано-Франковской области. Каждому пациенту проводили общеклиническое обследование, диагностическую люмбальную пункцию, КТ и ЯМР головного мозга, бактериоскопию ликвора на микобактерии туберкулеза и криптококки, исследование сыворотки крови на IgM и IgG к возбудителям TORCH-инфекций (CMV, HSV 1 и 2 типов, Toxoplasma gondii) методом ИФА, определение ДНК герпесвирусов, микобактерий туберкулеза, токсоплазм в ликворе методом ПЦР.

У всех пациентов диагностирована нейроинфекция с различной степенью патологии. По результатам обследования больных 1 пациенту поставлен диагноз прогрессирующая полифокальна лейкоэнцефалопатия, 7 - гнойный менингит, 1 -туберкулезный менингит, 1 - криптококковый менингит, 1 - криптококковый менингит в сочетании с гнойным менингитом, 2 - герпесвирусный (HSV1) энцефалит, 7 - очаговый церебральный токсоплазмоз. Очаговый токсоплазмозный энцефалит был монопатологией только у 3-х пациентов, у остальных он сочетался с другой патологией ЦНС: криптококковым менингитом - 2, абсцессом головного мозга - 1, Эпштейна-Бар вирусным энцефалитом и криптококковым менингитом - 1.

Часть пациентов исследована до и после проведенной антивирусной и противопаразитарной терапии.

Контрольную группу составляли ВИЧ-инфицированные, отрицательные по токсоплазмозу.

Метод ИФА
Исследуемый материал тестировали с использованием диагностической иммуноферментной тест-системы «DIA-Toxo-IgG» (ЧАО НПК «Диапроф Мед»). Тест-система сконструирована в формате непрямого ИФА. В составе иммуносорбента использованы очищенные природные антигены T/gondii, с которыми связываются специфические антитела на первом этапе реакции. После промывки иммуносорбента в реакцию вводят специфический пероксидазный конъюгат, изготовленный на основе мышиных моноклональных антител к IgG человека, которые выявляют образовавшиеся иммунные комплексы. Иммуноферментную реакцию проявляют раствором ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидина), в состав которого входит перекись водорода. Останавливают реакцию раствором серной кислоты.

При проведении тестирования сывороток крови на IgG к T.gondii, согласно Инструкции к тест-системе, исследуемый образец предварительно перед постановкой ИФА разводили 1:50 буфером для разведения исследуемых образцов. С помощью калибраторов, которые входят в состав набора и откалиброваны относительно 3-го Международного стандарта ВОЗ (Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, NIBSC), строили калибровочную кривую и полученное значение концентрации специфических IgG в сыворотке крови выражали в МЕ/мл. Кроме этого, в проведенных нами исследованиях анализируемый материал дополнительно разводили указанным буфером 2-кратно: сыворотки крови с 1:50 до 1:400, а ликвор – с 1/10 до 1/160. Результат анализа при этом выражали соотношением ОП/cut off, где

• ОП – оптическая плотность, полученная при тестировании исследуемого образца,
• cut off – граничное значение, которое рассчитывали по формуле,
• срК- + 0,15,
• срК- - среднее значение оптической плотности, полученное при анализе трех дублей отрицательного контроля,
• 0,15 – поправочный коэффициент.

Использование данного соотношения одновременно при учете результата анализа сыворотки крови и ликвора позволило сравнить концентрации IgG к T.gondii, как персистирующих, так и локализованных в нервной ткани организма больного.

Результаты и обсуждение

При исследовании ВИЧ-инфицированных с нейроинфекцией специфические IgG к T.gondii в сыворотке крови выявлены у 65 % больных (13 человек из 20 обследованных). У всех пациентов с положительным результатом на токсоплазмоз в организме персистировали специфические иммуноглобулины класса G в достаточно высоких концентрациях 70 – 176 МЕ/мл, которые указывали на перенесенное заболевание в прошлом (табл.1,.2).

При анализе ликвора данных больных у 84,6 % (11 больных из 13) были обнаружены IgG к T.gondii. У одного больного (№6), у которого концентрация специфических IgG в сыворотке крови составила 58 МЕ/мл, ликвор не исследовался. Отмечено, что при последовательном 2-кратном разведении 14 образцов ликвора, в которых тест-система выявила IgG к T.gondii, в 9 образцах (64, 3 %) специфические антитела обнаружены в исследуемом материале до его разведения 1:400, в 2 образцах - до разведений 1:100, 1:200 соответственно,. Необходимо отметить, что у всех пациентов, у которых IgG к T.gondii присутствовали в ликворе, они выявлялись и в сыворотке крови. Это свидетельствует о невозможности изолироанного появления специфических антител в ликворе при отсутствии их в крови. У 3 больных (№4, №5, №11) в ликворе которых обнаружены специфические IgG, по результатам КТ, диагноз токсоплазмоза не был установлен. Двое из них умерло, так и не получив своевременно специфической терапии. У одного больного после выписки через 1 месяц развился токсоплазменный множественный хориоретинит со значительным снижением зрения. В дальнейшем по анамнезу всем 3 больным был поставлен диагноз токсоплазмоз мозга. При исследовании больного (№13), прошедшего курс противопаразитарной терапии, IgG к T.gondii обнаружены только при разведении ликвора 1:10. Учитывая полученные данные, очевидно, что именно данное разведение ликвора необходимо использовать как минимальное при проведении ИФА, чтобы исключить возможность получения ложноотрицательных результатов при тестировании ликвора в тест-системе «DIA-Toxo-IgG».

У одного пациента (№10) IgG к T.gondii обнаружены только в сыворотке крови. По результатам расширенного обследования у него не подтвержден диагноз церебральный токсоплазмоз.

Сравнительный анализ значений соотношения ОП/cut off, полученных при исследовании образцов ликвора (в разведении 1:10), отобранных с интервалом 12-14 дней у больных, позволил установить снижение количества IgG к T.gondii у пациента № 1 с положительной динамикой заболевания в ходе проведения лечения (табл.1).

У 8 больных (контрольная группа - № 7, 8, 9, 12, 14, 15, 16, 17) мы не обнаружили IgG к T.gondii при исследовании в тест-системе «DIA-Toxo-IgG» образцов сывороток крови и ликвора.

Полученные данные по количеству IgG к T.gondii при нейроинфекции у ВИЧ-инфицированных, персистирующих в организме и локализованных в нервной ткани, представлены в табл.2. По результатам тестирования сывороток крови и ликвора в одинаковых 2-кратных разведениях от 1:50 до 1:16400 специфические антитела в ликворе выявлялись в меньших разведениях и с меньшими значениями ОП/cut off, чем в сыворотке у каждого больного. Очевидно, что у больных на ранних этапах развития нейроинфекции обсемененность возбудителем нервной ткани меньше, чем внутренних органов.

Таким образом, проведенные нами исследования образцов ликвора и сывороток крови ВИЧ-инфицированных с нейроинфекцией показали, что диагностические возможности иммуноферментной тест-системы «DIA-Toxo-IgG» позволяют выявлять IgG к T.gondii в указанном материале с высокой чувствительностью.. При этом ликвор перед тестированием необходимо разводить 1:10 раствором для разведения исследуемых образцов, который входит в состав тест-набора. Высокая информативная способность тест-системы определяет возможность ее использования в алгоритме диагностики этиологического фактора нейроСПИДа. Поскольку из всех оппортунистических инфекций токсоплазмоз в условиях иммунодефицита у больных ВИЧ представляет реальную угрозу их жизни, своевременное выявление возбудителя токсоплазмоза в качестве причины нейроинфекции предупредит осложнения в ходе развития заболевания.

Литература

1. ВИЧ-инфекция: клиника, діагностика и лечение. 2-е изд./В.В. Покровский, Т.Н. Ермак, В.В. Беляєва и др.– М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.
2. Запорожан В.М. ВИЧ-инфекция и СПИД/ В.М. Запорожан, М.Л. Аряєв. [2-е узд перероб. и доп.] – К. : “Здоров’я”, 2004 р. - 636с.
3. Церебральный токсоплазмоз // Лечение ВИЧ-инфекции, 2005 р./ под ред. Кристиана Хоффмана, Юргена К. Рокстро, Бернда Себастьяна Кампса. – 2005. [Електронний ресурс]. Режим доступу до кн. : HIVMedicine.com.
4. Ковалева Н.М. Токсоплазмоз как оппортунистическая инфекция / Н.М. Ковалева // Сучасні інфекції. – 2000.- №1. – С.44-50.
5. Возианова Ж.И. Инфекционные и паразитарне болезни : учебное пособие [для студ. висш. мед. учебн. учрежд.] в 3 т. / Ж.И. Возианова – К. : «Здоров’я», 2002. - Т.3. - 2002. – С.285-315.
6. Крамарев С.О. Лабораторна діагностика токсоплазмозу у вагітних і дітей / С.О. Крамарев, Л.В. Пипа // Лабораторна діагностика. – 2003. - №1. – С.21-25.

• Грижак Игорь Игнатьевич - к.м.н., доцент кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Ивано-Франковського национального медицинского университета, Украина;
• Дикий Богдан Николаевич - д.м.н., профессор, заведующий кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Ивано-Франковського национального медицинского университета, Украина;
• Прокофьева Ольга Алексеевна - заведующая лаборатории Центр профилактики и борьбы со СПИДом Ивано-Франковской области;
• Ганова Лариса Александровна – к.б.н., заведующая лаборатории иммунохимии;
• ЧАО НПК «Диапроф-Мед», Киев, Украина;
• Шепелин Константин Анатольевич, директор по развитию ООО «Эпидбиомед-диагностика», Москва, Россия.

Таблица 1: Результаты сравнительного тестирования сыворотки крови и ликвора ВИЧ-инфицированных с подозрением на токсоплазмоз в тест-системе «DIA-Toxo-IgG».

* - интервал между I и II взятием пробы составляет 12-14 дней,
** - при соотношении ОП/cut off больше 1,0 результат положительный, меньше 1,0 - отрицательный,
*** - диагноз обоснованный , но во время стационарного лечения не был установлен и пациенты не получали противопаразитарных препаратов.

Таблица 2: Результаты сравнительного анализа содержания IgG к Toxoplasma gondii в сыворотке крови и ликворе больных ВИЧ

* - при соотношении ОП/cut off больше 1,0 результат положительный, меньше 1,0 - отрицательный.