Оценка качества питательных сред для определения чувствительности к антибактериальным препаратам

© Группа авторов, 2013 УДК 57.08318;615.281.9
*Шепелин А. П., Морозова Т. П., Косилова И. С., Глазкова Г. П., Домотенко Л. В.
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Московская обл., п. Оболенск

Проведена сравнительная оценка качества питательных сред для определения чувствительности к антибиотикам. Установлено, что показатели качества импортных сред Мюллера-Хинтон соответству- ют требованиям, изложенным в методических указаниях МУК 4.12.1890-04. Отечественные питательные среды имеют ограничения по интерпретации результатов в отношении сульфаниламидных препаратов и триметоприма.

The comparative assessment of quality of nutrient media for determination of sensitivity to antibiotics was carried out. It was established that quality indices of imported Muller-Hinton nutrient media meet the requirements of methodological instructive regulations 4.12.1890-04. The domestic nutrient media have restrictions on results interpretation concerning sulfanilamides and trimethoprim.

Диско-диффузионный метод остаётся одним из самых простых полуколиче- ственных методов для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, широко используемым в практике бактериологических лабораторий. Результаты тестирования чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом (ДДМ) зависят от многих причин, но к числу наиболее важных относится качество питательных сред [1]. В соответствии с требованиями основного нормативного документа «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.12.1890-04), регламентирующего постановку ДДМ для оценки чувствительности, используют только специально предназначенные для этой цели среды, разрешённые к применению в Российской Федерации в установленном порядке, по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям раздела 5 [2]. В настоящее время универсальной средой для выполнения ДДМ, рекомендованной Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) США и Европейским комитетом по определению антимикробной чувствительности (EUCAST), является агар Мюллера-Хинтон (МХА), первоначально созданный для выделения бактерий рода Neisseria [3]. Для данной среды разрабатываются и регулярно пересматриваются критерии интерпретации результатов для большого количества современных антибиотиков и значения диаметров зон подавления роста контрольных штаммов.

В Великобритании и некоторых европейских странах для постановки ДДМ используется полусинтетическая питательная среда Изосенси- тест (Oxoid), в которой содержание компонентов неопределённого состава (гидролизатов, пептонов) сведено к минимуму [4]. В России широко применяется среда АГВ (агар Гевинталь- Ведьминой), созданная специально для тестирования чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам [5]. В 2010 г. был зарегистрирован отечественный агар Мюллера- Хинтон (регистрационное удостоверение №ФСР 2010/08257), производимый в Научно-исследовательском центре фармакотерапии (НИЦФ). Вопрос качества питательных сред для ДДМ в последнее время часто обсуждается в литературе [6-10]. Он касается как российской среды АГВ, так и агара Мюллера-Хинтон и даже Изо- сенситеста. В случае агара Мюллера-Хинтон отмечалась высокая вариабельность результатов, полученных на средах разных производителей, а общими недостатками сред являлось нестандартное, а для АГВ - очень высокое, содержание двухвалентных металлов (Ca и Mg), ингибиторов антагонистов фолиевой кислоты - тимина и ти - мидина. В ГНЦ ПМБ (Оболенск) разработана и почти десять лет выпускается сухая питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13687). Среда является аналогом среды АГВ, но вместо гидролизата кильки в её состав входит панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ). До введения в действие МУК 4.12.1890-04, учёт результатов, полученных на среде, проводился по интерпретационным критериям, разработанным для среды АГВ. Затем показатели качества выпускаемой среды были пересмотрены, и для производства питательной среды стали использовать специально обработанный ПГРМ с пониженным содержанием двухвалентных металлов с тем, чтобы она удовлетворяла требованиям новых МУК.

Контакты: shepelin.rabota@rambler.ru

Диско-диффузионный метод остаётся одним из самых простых полуколиче- ственных методов для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Результаты тестирования чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом (ДДМ) зависят от многих причин, но к числу наиболее важных относится качество питательных сред.

Цель данной работы - оценить качество питательной среды ГНЦ ПМБ при определении чувствительности тест-штаммов к антимикробным препаратам с использованием диско-диффузи- онного метода и сравнить его с качеством питательных сред аналогичного назначения.

Условия эксперимента

Материалы

В работе исследовали следующие питательные среды: Мюллера-Хинтон агар II (Becton Dickinson), кат. № 211438, лот 9174125, годен до 09.2013; Мюллера-Хинтон агар II (HiMedia) кат. № M 1084, лот 88898, годен до 05.2014; Мюллера-Хинтон агар (НИЦФ), серия 2, годен до 04.2014; среда АГВ (НПО «Микроген»), серия 1, годна до 06.2012; питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (ГНЦ ПМБ), серия 37, годна до 11.2013, серия 48, годна до 02.2014, серия 52, годна до 02.2014.

При оценке качества питательных сред руководствовались требованиями как МУК 4.12. 1890-04, так и МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» и определяли pH, прочность студня агаровых сред по Валенту, содержание двухвалентных металлов (Са, Mg, Zn), чувствительность среды, характер и скорость роста тест-штаммов (контроль роста), диаметры зон подавления роста тест-штаммов и пригодность использования питательных сред для определения чувствительности к антимикробным препаратам, в т. ч. сульфаниламидам и триметоприму [2, 11].
Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводили диско-диффузионным методом в соответствии с требованиями методических указаний «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.2.1890-04), используя диски производства НИЦФ (Санкт-Петербург), содержащие следующие антибиотики: гентамицин (10 мкг), тобра- мицин (10 мкг), амикацин (30 мкг), имипенем (10 мкг), ципрофлоксацин (5 мкг), цефтази- дим (30 мкг), триметоприм/ сульфаметоксазол (1,25 мкг/ 23,75 мкг), карбенициллин (100 мкг), хлорамфеникол (30 мкг), ампициллин (10 мкг), тетрациклин (30 мкг), неомицин (30 мкг), эритромицин (15 мкг) и доксициклин (30 мкг).

В качестве тест-штаммов использовали штаммы Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 и Enterococcus faecalis ATCC 29212,полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС, LGC Standards). Инокулят готовили суспендированием в физиологическом растворе колоний, выросших на кровяном агаре при температуре (37±1) оС в течение 18-20 ч, и доведением мутности суспензии до 0,5 стандарта McFarland (bioMerieux). Полученную суспензию высевали на агаровые среды с помощью тампона или пипетки и инкубировали при 35 оС в течение 18-24 ч. Диаметры зон ингибирования роста тест-штаммов измеряли в отражённом свете с помощью специальной линейки HiAntibiotic Zone Scale (HiMedia) . Интерпретацию результатов проводили с соответствии с Методическими указаниями [2].

Несовпадение результатов при сравнении диаметров зон подавления роста тест-штаммов, полученных на разных сериях питательных сред, расценивали при различии значений более чем на ±3 мм. Содержание двухвалентных металлов в питательных средах определяли методом пламенной атомной абсорбции на атомно-абсорбционном спектрометре Shimadzu AA-6200 с атомизацией в пламени стехиометрической смеси «ацетилен- воздух».

Результаты и обсуждение

Для оценки качества исследуемых питательных сред изучали характер роста тестируемых микроорганизмов. Тест-штаммы E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923 вырастали на всех питательных средах из разведения 10-7, содержащего примерно 1х10 КОЕ/мл. При этом колонии E. coli ATCC 25922 и S. aureus ATCC 25923 были типичными на всех питательных средах. Различия наблюдались лишь в морфологии колоний P. aeruginosa ATCC 27853.

На отечественных средах колонии выглядели более плоскими, расплывчатыми, нежели на импортных. Кроме того, характерный сине-зелёный или жёлто-зелёный пигмент отсутствовал у колоний псевдомонад, растущих на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтон производства НИЦФ.

Результаты тестирования антибиотикочув- стительности тест-штаммов E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, полученные на разных средах, незначительно (в пределах 2-3 мм) отличались между собой и находились в допустимых диапазонах значений диаметров зон подавления роста.

Остановимся более подробно на результатах, полученных для тест-штамма P. aeruginosa ATCC 27853, являющегося маркером качества питательной среды. В табл. 1 приведены данные, полученные при определении чувствительности P. aeruginosa к аминогликозидам, фторхиноло- нам, а также результаты тестирования чувствительности E. faecalis ATCC 29212 к триметоприму и сульфаметоксазолу.

Известно, что результаты определения чувствительности микроорганизмов с использованием ДДМ определяются диффузией антимикробного вещества из диска в агар. Скорость диффузии антимикробного препарата зависит от многих параметров, к которым относятся состав среды и её осмотическое давление, толщина агарового слоя, pH и др.

Как видно из табл. 1, результаты тестирования чувствительности P. aeruginosa на разных средах различаются между собой. Диаметры зон ингибирования роста вокруг исследованных дисков на всех трёх сериях среды ГНЦ ПМБ имели значения, которые соответствовали требованиям МУК 4.2.1890-04. На агаре Мюллера-Хинтон (НИЦФ) зоны ингибирования вокруг дисков с аминогликозидами (гентамицином, тобрами- цином и амикацином), имипенемом и ципроф- локсацином имели размеры, превышающие допустимые. На среде АГВ только вокруг дисков, содержащих гентамицин, наблюдалось превышение диаметра зоны подавления роста.

Известно, что результаты определения чувствительности микроорганизмов с использованием ДДМ определяются диффузией антимикробного вещества из диска в агар [11]. Скорость диффузии антимикробного препарата зависит от многих параметров, к которым относятся состав среды и её осмотическое давление, толщина агарового слоя, pH и др.

Состав среды АГВ от среды ГНЦ ПМБ отличается природой и концентрацией белковых гидролизатов. Так, среда АГВ содержит панкреатический гидролизат кильки, а в состав среды ГНЦ ПМБ входят панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон.

Как известно, активность некоторых антибактериальных препаратов (аминогликозидов, ма- кролидов, тетрациклинов, фторхинолонов и др.) зависит от величины pH питательных сред. Поэтому величина pH должна быть чётко регламентирована и в соответствии с требованиями МУК 4.12.1890-04 находиться в пределах 7,2-7,4. Анализ pH готовых сред показал, что все исследованные среды имели значение показателя концентрации водородных ионов (pH) в требуемом диапазоне (табл. 2). Как видно из табл. 2, оба импортных агара Мюллера-Хинтон имели pH, равную 7,2; агар Мюллера-Хинтон производства НИЦФ - 7,3; среда АГВ - 7,4; а pH четырёх серий среды ГНЦ ПМБ находились в пределах 7,25-7,3.

Помимо этого, скорость диффузии хорошо коррелирует и с таким показателем, как прочность питательной среды. И как видно из данных, приведённых в табл. 2, её значение различно для разных сред. Импортные агары обладают самой высокой прочностью, которая немного превышает 700 г. Прочность Мюллера-Хинтон агара (НИЦФ) значительно ниже и составляет 313 г. Прочность среды АГВ и сред ГНЦ ПМБ незначительно отличается и составляет 320 г и 400 г, соответственно.

Важным показателем качества питательной среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам (особенно к ами- ногликозидам, фторхинолонам, карбапенемам, тетрациклинам и некоторым другим) является строго стандартизированные концентрации двухвалентных металлов, прежде всего Са2+ и Mg2+. Методическими указаниями нормируется содержание Са2+ в среде на уровне 20-25 мг/л и Mg2+ - 10-12,5 мг/л.

Анализ элементного состава исследованных питательных сред показал, что не все среды удовлетворяют требованиям МУК 4.2.1890-04. Содержание двухвалентных металлов в трёх сериях среды ГНЦ ПМБ находится в требуемом диапазоне. Концентрация Mg в среде АГВ превышает нормативное значение примерно в три раза. Несмотря на значительное превышение концентрации двухвалентных металлов в среде АГВ, значения диаметров зон задержки роста тест-штамма P. aeruginosa вокруг дисков, содержащих аминогликозиды, были больше, чем на среде ГНЦ ПМБ, импортных агарах Мюллера- Хинтон и больше требований МУК 4.2.1890-04.

Возможным объяснением такой ситуации может быть следующее. При определении элементного состава питательной среды методом атомно-абсорбционной спектрометрии навеску сухой питательной среды подвергают минерализации с последующим растворением образовавшейся золы в растворе соляной кислоты. Как правило, в соляной кислоте растворяется вся получаемая зола, и все элементы, находящиеся в сухой среде, переходят в раствор соляной кислоты в виде катионов. Именно концентрацию таких катионов определяют при анализе элементного состава.

Таблица 1: Диаметры зон подавления роста (мм) P. Aeruginosa АТСС 27853 и E. faecalis АТСС 29212

Таблица 2: Результаты физико-химического анализа различных питательных сред

На основе полученного значения концентрации производится перерасчёт концентрации катионов в готовой питательной среде, при этом подразумевается, что все искомые элементы находятся в питательной среде в виде катионов. В отношении двухвалентных металлов такое утверждение не всегда правомерно, поскольку в готовой питательной среде они могут находиться в виде нерастворимых солей, например, фосфатов, которые образуются при взаимодействии катионов двухвалентных металлов с фосфатами в процессе автоклавирования. Такие среды непрозрачны и содержат заметный осадок. Именно такой средой была анализируемая серия среды АГВ.

Снижать проницаемость клеточных стенок псевдомонад и делать микробы резистентными к аминогликозидам и фторхинолонам могут только двухвалентные металлы в виде катионов. Учитывая, что исследованная нами серия среды АГВ после автоклавирования не была прозрачной, можно предположить, что вычисленное значение концентрации Ca и Mg в среде является суммарным, объединяющим содержание как катионов Са2+ и Mg2+, так и Ca и Mg в осадке. Таким образом, в среде АГВ содержание катионов двухвалентных металлов ниже нормируемого уровня. А при низких концентрациях катионов Са2+ и Mg2+ зоны ингибирования роста тест- штамма P. aeruginosa вокруг дисков, содержащих аминогликозиды, превышают критические значения.

Обращает внимание очень низкое содержание Са2+ и Mg2+ в МХА производства НИЦФ. Возможно, поэтому размеры зон ингибиции на данной среде, подобно среде АГВ, вокруг дисков с аминогликозидами и ципрофлоксацином значительно выше, чем на импортных агарах Мюллера-Хинтон.

В заключение хотелось бы остановиться ещё на одной важной характеристике питательных сред для определения чувствительности к антибактериальным препаратам: содержании тимина и тимидина. Наличие в питательной среде свободных тимина и тимидина снижает антимикробную активность in vitro антагонистов фолиевой кислоты - сульфаниламидных препаратов и триметоприма. Поэтому при определении чувствительности к сульфаниламидам и три- метоприму используемые питательные среды должны содержать минимальные концентрации тимидина и тимидина или не содержать их вообще.

Наличие в питательной среде свободных тимина и тимидина снижает антимикробную активность in vitro антагонистов фолиевой кислоты - сульфаниламидных препаратов и триметоприма. Поэтому при определении чувствительности к сульфаниламидам и тримето- приму используемые питательные среды должны содержать минимальные концентрации тимидина и тимидина или не содержать их вообще.

Полученные данные свидетельствуют о том, что питательная среда для определения чувствительности к антибактериальным препаратам производства ГНЦ ПМБ соответствует требованиям МУК 4.12.1890-04, но имеет ограничения в применении.

Ранее в литературе поднимался вопрос о пригодности среды АГВ для определения чувствительности микроорганизмов к антагонистам фолиевой кислоты [9, 12]. Полученные нами данные подтверждают вывод о том, что ни одна из отечественных сред не стандартизована по содержанию тимина и тимидина.

О пригодности питательной среды для определения чувствительности к антифолатам можно косвенно судить по результатам тестирования контрольного штамма E. faecalis ATCC 29212. Согласно требованиям МУК, среда считается удовлетворительной по качеству при диаметре зоны подавления роста E. faecalis ATCC 29212 вокруг диска с триметопримом/сульфаметоксазолом >20 мм. В табл. 1 приведены результаты тестирования чувствительности E. faecalis ATCC 29212 к данному антибактериальному препарату. При тестировании E. faecalis ATCC 29212 на импортных МХА получены зоны подавления роста 2830 мм вокруг диска триметопримом/сульфаме- токсазолом, а на отечественных средах (среда ГНЦМПБ, среда АГВ, среда МХА НИЦФ) подавления роста не наблюдалось.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что питательная среда для определения чувствительности к антибактериальным препаратам производства ГНЦ ПМБ соответствует требованиям МУК 4.12.1890-04, но имеет ограничения в применении. Она не может быть использована для определения чувствительности к антифолатам - сульфаниламидам и тримето- приму.
В настоящее время ни одна из отечественных питательных сред не предназначена для определения чувствительности к сульфаниламидным препаратам и триметоприму.

Литература

1. Ericsson H. M. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study // Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica, 1971, V.17, Suppl. - P. 1-90.
2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания (МУК 4.12.1890- 04). - М: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 91 с.
3. Muller J. H. etc. A protein-free medium for isolation of Gonococcus and Meningococcus // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1941, V. 48. - P. 330-333.
4. Turnidge J. etc. Antimicrobial susceptibility on solid media // Antibiotics in Laboratory Medicine. Ed. : Victor Lorian, 2005. - P. 8-60.
5. Гивенталь Н. И. и др. Изучение новой питательной среды АГВ для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в эксперименте // Антибиотики, 1978, № 1. - C. 53-58.
6. Pollock H. M. etc. Effect of different lots of Mueller-Hinton agar on the interpretation of the gentamicin susceptibility of Pseudomonas aeruginosa // Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1978, V. 14. - P. 360-367.
7. Andrews J. etc. Evaluation of media available for testing the susceptibility of Pseudomonas aeruginosa by BSAC methodology// Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, V.50. - P. 479-486.
8. Potz N. A. C. etc. Reliability of routine disc susceptibility testing by the British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) method// Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2004, V. 53. - P. 729-738.
9. Стецюк О. У. и др. Сравнение результатов определения чувствительности к антибиотикам грамотрицательных аэробных бактерий диско-диффузионным методом на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтон // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2004, Т. 6., № 2. - С. 155-167.
10. Barry A. L. etc. Susceptibility tests: diffusion test procedures // Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. / Balows A., Hausler W. J. Jr., Herrmann K. L., Isenberg H. D., Shadomy H. J., editors. - Washington, D.C: American Society for Microbiology, 1991. - P. 1117-1125.
11. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. МУК 4.2.2316-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008, C. 67
12. Стецюк О. У. и др. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2001, № 4. - С. 348-354.