Сравнительная оценка качества среды Сабуро отечественного и импортного производства

УДК: 579.083.13:576.8.083.3

Инфекция с участием грибов рода Candida spp. в настоящее время имеет устойчивый статус актуальной клинической проблемы. В последние годы грибы как возбудители болезней приобретают все больший удельный вес в структуре заболеваемости. Борьба с микозами, их ранняя диагностика и терапия требуют многосторонних знаний о мицелиальных и тканевых формах возбудителей, использования иммунологических методов исследований и целенаправленного эпидемиологического обследования с выявления факторов, определяющих динамику развития микотических поражений [1].

Основная масса грибов относится к условно патогенным микробам (УПМ). Являясь составной частью окружающей среды, некоторые свободно живущие виды грибов, контактируя с организмом в условиях сниженного иммунного статуса, колонизируют биотопы организма, вызывая развитие ГВЗ. Чаще всего микотические поражения человека вызывают дрожжеподобные грибы рода Candida: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, реже других видов. Возрастание случаев микозов среди населения связано с ухудшением экологических условий, нерациональным использованием антибиотиков, увеличением в популяции доли иммуноком- прометированных лиц. Дифференциацию дрожжеподобных возбудителей проводят по культуральным, морфологическим и тинкториальным, ферментативным и антигенным свойствам. Существуют тест-системы, облегчающие работу микробиологов по идентификации дрожжеподобных грибов, в тоже время необходимость изучения ферментативной и ассимиляционной способности грибов по стандартным методикам, остается актуальной. В ГНЦ ПМБ поставлена задача разработки среды для выделения грибов, содержащей в своем составе глюкозу, утилизируемую всеми грибами рода Candida.

Для выделения и количественного учёта C. albicans при санитарно-микологических исследованиях в среды добавляются антибиотики, 2% раствор теллурита калия, метабисульфит натрия или калия.

Белковой основой классического варианта среды Сабуро является пептон (мясной или казеиновый). В ГНЦ ПМБ белковой основой разрабатываемых сред является панкреатический гидролизат рыбной муки и панкреатический гидролизат казеина, обеспечивающие питательные потребности не только широкого круга бактерий, но и грибов.

Цель исследования

Изучение диагностической ценности (специфическая активность: чувствительность, скорость роста, стабильность основных биологических свойств микроорганизмов, дифференцирующие и ингибирующие свойства), питательной среды для выращивания и подсчёта числа дрожжевых и плесневых грибов № 2 ГРМ (Сабуро) в сравнительных испытаниях с коммерческими препаратами, выпускаемыми в соответствии с нормативной документацией и в период их срока годности.

А. П. Шепелин
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Московская обл., п. Оболенск

Проведена сравнительная оценка качества питательной среды Сабуро отечественного (ФГУН ГНЦ ПМБ) и импортного производства (Pronadisa, HiMedia). Отечественная среда Сабуро ГНЦ ПМБ намного дешевле импортных. Состав питательной среды № 2 ГРМ Сабуро обеспечивает чёткие морфологические признаки, являющиеся основой дифференциальной диагностики грибов рода Candida от других дрожжеподобных грибов, плесневых грибов и микробов-ассоциантов. Качество питательной среды Сабуро производства ГНЦ ПМБ не уступает импортным аналогам по всем параметрам, а по некоторым показателям превосходит их.

Материалы и методы

Материалами для исследования служили питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро), питательные агары Сабуро различных фирм-производителей: Sabouraud Dextrose Agar (Pronadisa, Испания) и Sabouraud Dextrose Agar (HiMedia, Индия), в качестве ингибитора использовался 2% раствор теллурита калия.

Для определения специфической активности сравниваемых питательных сред использовались следующие музейные тест-штаммы микроорганизмов: Candida albicans, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, получены из ГИСК им. Л. А. Тарасе- вича, а также отдела коллекционных культур ФГУН ГНЦ ПМБ.

Взвеси тест-штаммов и микробов ассоциантов готовили в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации, соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-86П). Исходные взвеси доводили до нужных концентраций, используемых при исследованиях в соответствии с Инструкциями для каждого испытуемого и контрольного препаратов.

При работе использовали общепринятые физико-химические методы контроля, в том числе регламентируемые в соответствии с ТУ на питательные среды аналогичного назначения, в соответствии с МУК 4.2.2316-08 [3].

1. Определение внешнего вида.
2. Определение растворимости.
3. Определение прозрачности и цветности раствора.
4. Определение рН.
5. Определение потери в массе при высушивании.
6. Определение аминного азота.
7. Определение хлоридов (в пересчёте на натрия хлорид).
8. Определение прочности студня среды.

Чувствительность, скорость роста, ингибирующие свойства изучали в соответствии с МУК 4.2.2316-08 [3], а также инструкциями по применению на коммерческие питательные среды, инструкцией по применению на питательную среду № 2 ГРМ (Сабуро). Качественное определение общего числа дрожжевых и плесневых грибов проводили по методике, изложенной в ГосФармокопеи XI [4].

Биохимические характеристики и стабильность сохранения основных биологических свойств микроорганизмов определяли с использованием тест-систем (системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов (СИБ), производства ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, «ПБДЭ» - пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии производства «НПО «Диагностические системы»»), а также биохимического анализатора «Multiscan as- sent» (Финляндия).

Производство питательной среды № 2 ГРМ (Сабуро) основано на применении гидролизата, имеющего низкий рН. Кислотность среды в значительной степени подавляет рост сопутствующей микрофлоры, но при этом не препятствует хорошему росту грибов рода Candida. Поскольку культуральный метод предполагает посев материала на плотные питательные среды с последующим выделением и идентификацией чистой культуры микроорганизма, для придания среде № 2 ГРМ (Сабуро) дополнительных селективных свойств, нами рекомендуется применение 2% раствора теллурита калия [4].

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований изучен компонентный состав ведущих зарубежных фирм (табл. 1), а также химические свойства разработанной питательной среды № 2 ГРМ (Сабуро) в сравнении с аналогами (табл. 2).

В качестве белковой основы для питательной среды № 2 ГРМ (Сабуро) используются ферментативные гидролизаты рыбной муки и казеина, производимые Научнопроизводственным отделом «Питательные среды» ГНЦ ПМБ, обеспечивающие хорошие ростовые свойства. Ведущие зарубежные фирмы, с этой же целью, применяются микологические пептоны.

Сравнительный анализ физико-химических характеристик показал, что питательные агары Сабуро различных фирм-производителей: Sabouraud Dextrose Agar (Pronadisa, Испания) и Sabouraud Dextrose Agar (HiMedia, Индия) по химическим характеристикам совпадают с питательной средой № 2 ГРМ (Сабуро), за исключением показателя по прочности геля. Уменьшение концентрации агара не повлияло на основные биологические показатели среды.

Приведённые данные являются средними значениями результатов, по меньшей мере, трёх измерений.

Таблица 1: Составы питательных агаров Сабуро различных производителей

Таблица 2: Физико-химические характеристики питательных агаров Сабуро различных фирм

Следующим этапом исследований было сравнение чувствительности агаров Сабуро. Все питательные среды готовились по соответствующим методикам без ингибитора и с применением 2% раствора теллурита калия (5,0 мл на 1 л готовой среды). Чувствительность среды определяли по наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний Candida spp. на всех засеянных чашках Петри. Для этого из приготовленных разведений (10-5, 10-6, 10-7) брали по 0,1 мл взвеси, содержащей соответственно 1000, 100 и 10 клеток и внесли в хорошо просушенные чашки Петри с агарами Сабуро. Инокулят тщательно распределяли по поверхности среды, используя стерильные шпатели, инкубировали при температуре (33±1)° С. Параллельно делали высевы на ГРМ-агар (для контроля роста). Учёт результатов проводили через 12, 18, 24, 48 ч инкубации с целью определения скорости роста.
Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3: Сравнительная характеристика питательных агаров Сабуро по биологическим показателям

Данные, представленные в табл. 3, получены через 48 ч инкубации, так как через 12 и 24 ч инкубации колонии на агарах Сабуро с теллуритом калия ещё недостаточно сформированы. Оптимальным временем инкубации следует считать 40-48ч ч при температуре (33±1)° С.

Далее определяли показатель ингибиции по отношению к микробам-ассоциантам B. ce- reus, S. aureus, E. cloacae, E. aerogenes, E. coli, E. faecalis, S. epidermidis. При определении показателя ингибиции посевная доза микробов-ассоциантов должна превышать посевную дозу патогенной микрофлоры более чем в 100 раз. Приготовлены взвеси тест-штаммов, содержащие 105, 106, м.к./мл. Для придания агарам Сабуро селективных свойств, в качестве ингибиторов использовали 2% раствора теллурита калия (5 мл на 1 л среды), антибиотики (циклогексимид 0,4 г/мл, пенициллин 20 ЕД, стрептомицин 40 мг/мл), метабисульфит натрия (2 г/л).

Добавление в среду ингибиторов подавляет рост всей сопутствующей микрофлоры. Рост тест-штаммов C.
A. niger на питательных агарах Сабуро имели типичную морфологию:

C. albicans — гладкие, выпуклые белого цвета, в виде полусферы с ровным краем. Aspergillus niger имели разветвлённый, многоядерный мицелий чёрного цвета. Колонии C. albicans в присутствии теллурита калия приобретают чёрную окраску.

Выводы

Анализируя результаты по определению чувствительности разрабатываемой среды и скорости роста можно сделать вывод о высокой чувствительности среды, так как на всех засеянных чашках при посеве тест-штаммов из разведений 10-5, 10-6, 10-7 грибы рода Candida вырастали в виде хорошо сформированных, более крупных, чем на коммерческих средах, колоний (рис.1).

Рис. 1. Рост колоний Candida spp. на среде Сабуро разных производителей.

Интенсивность окрашивания, характерная для Candida в присутствии теллурита калия, ярче выражена на питательной среде № 2 ГРМ (Сабуро), чем на Sabouraud Dextrose Agar (Pron- adisa) и Sabouraud Dextrose Agar (HiMedia) (рис. 2).

Состав питательной среды № 2 ГРМ (Сабуро) обеспечивает чёткие морфологические признаки, являющиеся основой дифференциальной диагностики грибов рода Candida от других дрожжеподобных грибов, плесневых грибов и микробов-ассоциантов.

Рис. 2. Рост колоний Candida spp. на среде Сабуро разных производителей в присутствии теллурита калия.

Литература

1. Кашкин П. Н., Лисин В. В. Практическое руководство по медицинской микологии. - Л., 1983- - 192 с.
2. Микробиологическая диагностика вульво-вагинального кандидоза. Метод. рекомендации / Карпунина Т. И., Олина А. А., Машуров М. Г. - Пермь, 2006. - 36 с.
3. Методы контроля бактериологических питательных сред. Метод. указания МУК 4.2.2316-08. Утверждены Роспотребнадзором 18. 01. 2008.
4. XI Государственная Фармакопея СССР /Вып. 2. - М.: 1990. - 496 с.